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題目中的干細(xì)胞專指間充質(zhì)干細(xì)胞

2021-07-29 18:26:00

題目中的干細(xì)胞專指間充質(zhì)干細(xì)胞
       細(xì)胞療法和再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)品擁有非常獨(dú)特的產(chǎn)業(yè)鏈，在整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈上，細(xì)胞必須保持活力和功能。超低溫保存已成為再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)品物流過程和供應(yīng)鏈的重要組成部分。在培養(yǎng)液中運(yùn)輸?shù)幕罴?xì)胞只有很短的保質(zhì)期。保存方法不佳容易限制了使用間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）治療疾病的能力。比如Prochymal（MSC注射液）用于治療移植物抗宿主病，但在III期臨床試驗(yàn)中失敗，細(xì)胞解凍后功能不佳是導(dǎo)致治療失敗的原因之一[1, 2]。
        當(dāng)然，Prochymal（MSC注射液）的失敗，不僅僅有解凍后細(xì)胞功能下降的原因，還可能存在更多的原因，詳情請(qǐng)見本公眾號(hào)之前的分析文章《具有免疫抑制能力的MSC為何敗在治療GVHD的3期臨床試驗(yàn)？》
 
       凍存降低MSC的活率和功能低溫組織儲(chǔ)存研究的起源可以追溯到19世紀(jì)末[3]。MSC被使用之前，需要經(jīng)過一系列的各種檢測(cè)，從而保證了MSC注射液的安全性。MSC作為種子細(xì)胞或者工作細(xì)胞，進(jìn)行超低溫凍存，從而在時(shí)間上滿足各種檢測(cè)的需求。 
 
       不管MSC是作為種子細(xì)胞，還是直接制備成注射液的工作庫的細(xì)胞，要超低溫凍存MSC在-80度冰箱和液氮（液相/氣相液氮罐）中，都需要用到含有冷凍保護(hù)劑（CPA）的凍存液。這些冷凍保護(hù)劑可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍和解凍這兩個(gè)過程所帶來的損傷。
 
        MSC的應(yīng)用，有2種常見的使用方式：（1），使用培養(yǎng)新鮮的MSC制備成干細(xì)胞注射液；（2），使用凍存的MSC直接制備成干細(xì)胞注射液。早些年，美國(guó)的干細(xì)胞公司多采用第2種使用方式，目前已經(jīng)意識(shí)到這種方式的弊端。而我國(guó)更多的是采用第1種使用方式。這兩種使用方式各有優(yōu)缺點(diǎn)。
 
       由于超低溫保存，MSC細(xì)胞活率會(huì)受到一定程度的影響，基本上都出現(xiàn)細(xì)胞活率下降[1, 4-8]。有的研究團(tuán)隊(duì)采用的凍存方案（包括冷凍保護(hù)劑配方和凍存/復(fù)蘇的操作）會(huì)導(dǎo)致MSC低至44%的活率[1]，這個(gè)44%的活率還不是最低的，還有更低的36%[5]。經(jīng)過該凍存方案處理的MSC，出現(xiàn)臨床治療效果欠佳，大部分人沒意識(shí)到是凍存方案出問題。舉一個(gè)例子來說明這個(gè)問題：有一個(gè)手力很弱雞的人，用一把刀來砍樹，結(jié)果沒砍倒樹，然后狠狠地責(zé)備這把刀不能砍樹，其實(shí)就是選擇性忽視了自己手力的弱雞。當(dāng)然，也有團(tuán)隊(duì)在處理MSC凍存降低活率方面做的比較好，經(jīng)過凍存處理，MSC復(fù)蘇后的活率可以均達(dá)到88%以上[8]。 
 
       直接采用液氮凍存的MSC，只是在臨床應(yīng)用前進(jìn)行解凍復(fù)蘇，然后直接給與MSC回輸治療，這樣的操作會(huì)導(dǎo)致MSC出現(xiàn)免疫抑制功能的嚴(yán)重下降[1, 2]。另一團(tuán)隊(duì)也證實(shí)了MSC經(jīng)過凍存后出現(xiàn)免疫抑制能力下降，即使細(xì)胞活率達(dá)到88%以上[8]。比較詭異的是，著名的卡羅琳斯卡大學(xué)醫(yī)院的某干細(xì)胞團(tuán)隊(duì)，其MSC經(jīng)過凍存后的活率也只有70%，但是卻通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來證明“凍存”這個(gè)程序能提高M(jìn)SC的免疫抑制能力[4]。經(jīng)過凍存解凍后立刻回輸使用的MSC，更容易被體內(nèi)的免疫細(xì)胞（T細(xì)胞）所殺傷，加速了機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)輸入的MSC的清除[9]。凍存不僅會(huì)影響到MSC的活率和免疫抑制功能，而且還會(huì)誘導(dǎo)MSC出現(xiàn)一定程度的細(xì)胞衰老[7, 8]。
 
        一項(xiàng)系統(tǒng)性綜述比較了來自41個(gè)獨(dú)立研究的10個(gè)物種的骨髓MSC解凍后的評(píng)估報(bào)告，發(fā)現(xiàn)MSC的形態(tài)、免疫表型、分化和增殖潛力在很大程度上不受低溫保存的影響，但27%的研究報(bào)告存活率顯著降低[10]。因此，需要重視MSC的凍存對(duì)MSC應(yīng)用療效的影響。    故，本文重點(diǎn)針對(duì)第2種使用方式做詳細(xì)的介紹，讓大家認(rèn)識(shí)到第2種方式的致命缺陷，從而避免或者做出改良，進(jìn)一步推動(dòng)干細(xì)胞行業(yè)的發(fā)展。
 
       解凍4小時(shí)內(nèi)，人骨髓MSC的細(xì)胞存活率稍微下降，細(xì)胞凋亡率增加（最高可達(dá)30%），代謝活性和黏附能力降低；解凍后24h，人骨髓MSC的細(xì)胞活力恢復(fù)，細(xì)胞凋亡率下降，但代謝活性和黏附能力仍低于新鮮細(xì)胞[11]。凍存和解凍后的細(xì)胞受到各種類型的壓力，導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架發(fā)生變化[12]。有研究指出MSC解凍后黏附能力低，是因?yàn)镸SC胞內(nèi)的F肌動(dòng)蛋白被破壞，而不是MSC細(xì)胞表面黏附分子脫落[13]
 
       有意思的是，在經(jīng)歷了凍存和解凍之后，三個(gè)不同供體來源的骨髓MSC細(xì)胞之間出現(xiàn)明顯的生物學(xué)功能的差異，而這種變異可能與捐獻(xiàn)者的年齡和種族有關(guān)[11]。有研究提出，24小時(shí)的恢復(fù)期可能會(huì)使MSC恢復(fù)到更好的功能狀態(tài)[6, 11]。一般來說，MSC經(jīng)過解凍復(fù)蘇后進(jìn)入傳代培養(yǎng)階段，MSC的增殖能力和功能特性得到完美的恢復(fù)[14-16]。
 
       另外，在超低溫保存中，細(xì)胞在低溫等極端條件下會(huì)大量產(chǎn)生活性氧（ROS）[17]，ROS造成的損害可歸因于脂質(zhì)過氧化[18]、蛋白質(zhì)氧化[19]和DNA損傷[20, 21]？寡趸瘎┡c冷凍保護(hù)劑聯(lián)合使用可提高冷凍保存效率，但濫用抗氧化劑可能會(huì)產(chǎn)生不良結(jié)果[22]。 
 
冷凍保護(hù)劑介紹

        常用的冷凍保護(hù)劑有2類：（1）滲透性冷凍保護(hù)劑，比如二甲基亞砜（DMSO）、甘油（GLY）、乙二醇（EG）或丙二醇（PG）等。目前常用的冷凍保護(hù)劑是二甲基亞砜（10%），在冷凍過程之前加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，增加細(xì)胞膜的孔隙度，從而使水可以更自由地流過細(xì)胞膜，有助于防止胞內(nèi)水晶體的形成[23-25]。（2）非滲透性冷凍保護(hù)劑，比如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、棉籽糖、蔗糖和海藻糖等。
 
        DMSO是最常用的冷凍保護(hù)劑。人骨髓MSC、豬脂肪MSC和犬骨髓MSC，在10%DMSO的保護(hù)下，能在液氮中長(zhǎng)期保存數(shù)年而不影響MSC的功能特性[26-28]。所有被測(cè)試的冷凍保護(hù)劑都能夠維持羊水來源的MSC的表面標(biāo)記表達(dá)、基因表達(dá)和分化，還發(fā)現(xiàn)了用DMSO或甘油凍存MSC比蔗糖或海藻糖有更高的活率[29]。在10%DMSO和10%自體血漿的凍存液中冷凍保存超過20年的骨髓細(xì)胞被解凍復(fù)蘇后，能培養(yǎng)出骨髓MSC，但是復(fù)蘇培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁率僅為種子細(xì)胞的50%，繼續(xù)培養(yǎng)則MSC恢復(fù)正常功能狀態(tài)[30]。
 
       比較5%、10%和20%的DMSO凍存豬骨髓MSC的存活率、CFU-F，以及Bak和Bcl2的表達(dá)，結(jié)果是凍存MSC的存活率和CFU-F形成數(shù)與DMSO濃度成反比，經(jīng)5%DMSO凍存的MSC存活率與對(duì)照組（新鮮MSC）相當(dāng)，但是MSC在5%和10%的DMSO中的凍存效果無顯著差異[31, 32]。也有一篇文章提到DMSO的濃度可以降至2%，人脂肪MSC在解凍復(fù)蘇后的細(xì)胞活率可以維持在80%以上[33]。
 
       當(dāng)然滲透性和非滲透性冷凍保護(hù)劑也可以一起組合使用，比如棉籽糖和DMSO組合冷凍哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞，可以獲得較高的冷凍存活率、受精率和發(fā)育率[34]；低濃度的乙二醇（EG）與DMSO組合提高了大鼠和人胰島細(xì)胞的產(chǎn)量、存活率和很好的保障了葡萄糖刺激的胰島素釋放的功能[35]；還可以DMSO、乙二醇和蔗糖三者混合后凍存豬的囊胚[36]。如果MSC混合添加的DMSO的凝膠膠原支架，即使凍存在-80度的冰箱里，6個(gè)月的時(shí)間能維持90%以上的活率[37]。由4%DMSO+6%海藻糖+10%FBS組成的凍存液，人脂肪MSC細(xì)胞解凍后存活率可達(dá)80%以上[38]。同樣的凍存液配方（5%DMSO+2%PEG+3%海藻糖+2%BSA），對(duì)不同動(dòng)物來源的MSC產(chǎn)生不同的影響（活率和代謝水平）；相比較于大鼠和牛的MSC，這個(gè)凍存液配方更適合小鼠MSC[39]。
 
       常用的冷凍保護(hù)劑如DMSO對(duì)細(xì)胞有溫度、時(shí)間和濃度依賴性的毒性效應(yīng)，并在患者中引發(fā)不良反應(yīng)[40, 41]。尋找DMSO的無毒替代品，也是一個(gè)臨床應(yīng)用所訴求的發(fā)展方向。1%脯氨酸和10%四氫甲基嘧啶羧酸（ectoin）組合凍存人MSC，具有和DMSO一樣的凍存效果（90%），只是比商品化的無DMSO冷凍溶液Biofreeze稍微遜色[42]。海藻糖、蔗糖、甘油、甘露醇和肌酸搭配組合凍存T細(xì)胞，也能達(dá)到80%左右的活率[43, 44]。無DMSO和無血清的凍存液，主要的冷凍保護(hù)劑是蔗糖、海藻糖和棉籽糖，輔助電穿孔技術(shù)（使得胞內(nèi)的水得以流出胞外），凍存人臍帶MSC，MSC細(xì)胞的存活率最高為80%，MSC在解凍后24小時(shí)方可貼壁，但是胞內(nèi)的空泡明顯增多[45]。
 
冷凍保護(hù)劑的保護(hù)原理

       添加了冷凍保護(hù)劑的凍存液，一般都是高滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）的。當(dāng)細(xì)胞從生理溶液轉(zhuǎn)移到低溫保存溶液時(shí)，由于胞外溶液中的滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）較高，細(xì)胞會(huì)脫水，同時(shí)低溫保存溶液的小分子（如DMSO）擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)時(shí)，細(xì)胞體積會(huì)緩慢減少；如果冷凍保存液中只有非穿透性冷凍保護(hù)劑（如葡聚糖和蔗糖），細(xì)胞也會(huì)脫水并保持脫水狀態(tài)，只是冷凍保護(hù)劑不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[46, 47]。在解凍復(fù)蘇階段，水從細(xì)胞外的低滲溶液迅速移動(dòng)到細(xì)胞內(nèi)的高滲透溶液，而小分子冷凍保護(hù)劑則向相反的方向緩慢移動(dòng)，導(dǎo)致細(xì)胞體積膨脹，并達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓恢復(fù)平衡。所以，在細(xì)胞冷凍處理和解凍復(fù)蘇的過程中，稍有差錯(cuò)，細(xì)胞就會(huì)因?yàn)闈B透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）的過度變化，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂而死亡。這就是細(xì)胞的滲透壓力性損傷。 
 
        細(xì)胞冷卻凝固時(shí)，細(xì)胞內(nèi)剩余的水量受冷卻階段水外流速率的影響，影響這一速率的三個(gè)變量是：細(xì)胞表面積與體積的比率、膜的透水性和冷卻速率[48]。也就是說，與較小細(xì)胞的脫水相比，較大細(xì)胞的脫水本質(zhì)上是緩慢的。應(yīng)根據(jù)細(xì)胞大小考慮冷凍保存期間的調(diào)整，以便在玻璃化發(fā)生之前有足夠數(shù)量的水退出？梢酝ㄟ^添加不同的冷凍保護(hù)劑來改變細(xì)胞膜的透水性。冷卻速度也是可以調(diào)整的。 
 
       冷凍保護(hù)劑通過加強(qiáng)氫鍵來改變水的低溫行為變化，包括：冰晶形態(tài)的變化，冰凍過程中的冰凍溫度和冰量[49, 50]。冷凍保護(hù)劑一般是高滲的，將細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間置于冷凍保護(hù)劑中，可導(dǎo)致兩種獨(dú)立的損傷機(jī)制：滲透壓力和生物化學(xué)毒性[51]。
 
       滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）變化導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，如前所述。含DMSO的冷凍保護(hù)劑，通？梢杂^察到DMSO對(duì)細(xì)胞活力的不良影響，這是由DMSO導(dǎo)致的生物化學(xué)毒性損傷。DMSO添加到冷凍保護(hù)劑溶液中會(huì)出現(xiàn)放熱現(xiàn)象，因此，需要提前配置和預(yù)冷冷凍保護(hù)劑溶液。為了在解凍后去除冷凍保護(hù)劑溶液，可以使用滲透壓稍高的洗滌液慢慢稀釋細(xì)胞，然后在必要時(shí)洗滌細(xì)胞[52]。因此，對(duì)于新的低溫保存液的開發(fā)，評(píng)估冷凍保護(hù)劑的生化毒性是至關(guān)重要的。理想情況下，冷凍保存溶液的成分應(yīng)該是臨床級(jí)的。
 
細(xì)胞凍融的程序

        基本原則：慢凍速融即使細(xì)胞有冷凍保護(hù)劑的保護(hù)，在冷凍過程中，也需要非常注意溫度的下降程序？偟囊笫窃诶鋬鲞^程中，盡可能減少胞內(nèi)冰晶的出現(xiàn)，即盡可能讓胞內(nèi)流動(dòng)的水通過滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）差的存在而流出胞外。實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)操作是經(jīng)過4個(gè)溫度梯度的適應(yīng)性過渡變化：4度、-20度、-80度、液氮。這種常規(guī)操作很難做到標(biāo)準(zhǔn)化和精準(zhǔn)化，F(xiàn)在可以通過使用可控速率的設(shè)備（程序降溫儀）來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞環(huán)境能以穩(wěn)定的1度/分鐘（或其他速率）的幅度來降溫。
       
       冷凍過程中，需要將細(xì)胞從冰箱或其他設(shè)備轉(zhuǎn)移到存儲(chǔ)液氮罐，在此轉(zhuǎn)移過程中，需要快速操作，避免細(xì)胞可能會(huì)迅速升溫而導(dǎo)致冷凍保護(hù)劑熔化，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。由于滲透性冷凍保護(hù)劑通過氫鍵與水發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，水的冰點(diǎn)被降低，可與自身相互作用形成晶體所需的關(guān)鍵位點(diǎn)的水分子就會(huì)減少。
 
       凍存細(xì)胞的復(fù)蘇，必須給細(xì)胞迅速升溫，以防止冰的再結(jié)晶。解凍后細(xì)胞的活率取決于解凍過程中，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外冰晶的數(shù)量和大小，因?yàn)榘麅?nèi)外的冰晶能直接刺破細(xì)胞膜和胞內(nèi)亞器官。 
 
       常規(guī)做法是將樣品從儲(chǔ)存庫/冰柜中取出，浸泡在37攝氏度的水浴中，然后輕輕旋轉(zhuǎn)，直到冰消失，以實(shí)現(xiàn)最大的存活率[53]。用水浴解凍細(xì)胞有幾個(gè)明顯的局限性。由于技能或習(xí)慣的原因，不同的操作員可能不會(huì)以完全相同的方式執(zhí)行解凍程序。減少解凍過程的可變性，需要訓(xùn)練有素的操作員，并建立標(biāo)準(zhǔn)化的解凍程序。在水浴中解凍的細(xì)胞也有被污染的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)樗?duì)環(huán)境是開放的。新的干式解凍裝置，可以克服水浴鍋中解凍細(xì)胞的限制，尤其適用于解凍有價(jià)值的細(xì)胞療法。
 
        解凍后洗滌是去除冷凍保護(hù)劑最常見的方法，即對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌液或培養(yǎng)液重懸后離心，去除上清液，然后將細(xì)胞重新懸浮在洗滌液或培養(yǎng)液中。然而，需要注意的是，解凍后洗滌會(huì)造成凍存細(xì)胞的數(shù)量損失。
 
MSC注射液的低溫運(yùn)輸

        MSC注射液的低溫運(yùn)輸也是一個(gè)不可忽視的小問題，能影響到MSC在應(yīng)用前的細(xì)胞活率。故而目前都建議MSC注射液（在人血清白蛋白的保護(hù)下）在24小時(shí)內(nèi)使用[54]。人脂肪MSC在5°C的含海藻糖的保存液中24小時(shí)后，MSC的存活率可達(dá)95%[55]。人骨髓MSC含海藻糖的保存液中4度冷藏72小時(shí)后，MSC的存活率不到80%，但MSC的免疫抑制功能稍有下降[56]。MSC重懸在含40 mM海藻糖的細(xì)胞保存液中，4度環(huán)境下，MSC在7天的存活率保持在90%以上[57]。
 
        凍存的細(xì)胞，尤其是制備成注射液后的細(xì)胞，在運(yùn)輸過程中可能會(huì)經(jīng)歷各種應(yīng)力，包括溫度波動(dòng)、機(jī)械振動(dòng)和沖擊以及壓力變化。減少樣品在運(yùn)輸過程中的可變性和保持穩(wěn)定性，需要全面的運(yùn)輸考慮和制定經(jīng)過驗(yàn)證的運(yùn)輸流程，即運(yùn)輸流程盡可能地在經(jīng)歷各種情況后不影響細(xì)胞的功能。
 
3D支架的聯(lián)合使用

       將MSC貼附在生物相容性材料制成的支架上進(jìn)行冷凍保存，形成即用的移植單元，用于修復(fù)骨、軟骨或皮膚的損傷。常見做法是將MSC冷凍保存在海藻酸鹽微球中。海藻酸鈉是一種天然多糖，具有吸水性，通過吸收水分可以防止在凍結(jié)過程中形成大冰晶，良好的生物相容性和生物降解性。在10%DMSO的存在下，冷凍保存的海藻酸鹽包裹的MSC獲得了90%的解凍后存活率[58]。將臍帶來源的MSC接種于含10%DMSO的海藻酸鹽-明膠支架中，再凍存于液氮，但是復(fù)蘇后細(xì)胞死亡較多，而且24小時(shí)的增殖速度減慢[59]。
 
        在一項(xiàng)研究中，將一段臍帶（2-3厘米）浸泡在含有10%DMSO和0.2M蔗糖的培養(yǎng)基中，并以1/分鐘的速度冷卻到-80度，然后轉(zhuǎn)移到液氮中保存5~29天，組織解凍復(fù)蘇后能繼續(xù)培養(yǎng)出MSC，但是MSC增殖速度慢和細(xì)胞數(shù)量稀少[60, 61]。甚至也有報(bào)告臍帶組織經(jīng)過含10%DMSO、5%甘油和20%FBS的凍存液冷凍保存在液氮后，未能從解凍復(fù)蘇的臍帶中培養(yǎng)出MSC[62]。相類似的，冷凍完整的牙齒中大約只有20%-30%經(jīng)過解凍復(fù)蘇后培養(yǎng)出牙髓MSC[16, 63]。
 
總結(jié)

        理論上，MSC凍存在-196度的液氮里面（或氣相液氮），細(xì)胞所有的生命活動(dòng)都是處于靜止?fàn)顟B(tài)，那么細(xì)胞的生命能永恒保存，只要不出現(xiàn)液氮補(bǔ)充不及時(shí)等情況。
 
       雖然冷凍保存程序可能會(huì)影響幾個(gè)細(xì)胞過程，包括細(xì)胞存活、細(xì)胞功能、蛋白質(zhì)表達(dá)、DNA完整性（表觀遺傳）、細(xì)胞骨架和核結(jié)構(gòu)，但是相同的凍存方案對(duì)不同類型的細(xì)胞有不同程度和不同方面的差異化影響[64, 65]。
 
       除了凍存液配方，合適的凍存細(xì)胞濃度也是一個(gè)不可忽視的影響因素。幾項(xiàng)研究表明，較高的有核細(xì)胞濃度（高達(dá)2億個(gè)細(xì)胞/毫升）對(duì)低溫保存劑具有良好的耐受性，并可產(chǎn)生良好的臨床結(jié)果[66, 67]。也有專家建議人MSC的細(xì)胞凍存濃度為(2-25)x106/毫升[68]。這個(gè)細(xì)胞濃度的范圍，還是比較寬泛的。
 
       冷凍保存細(xì)胞的目的是保持細(xì)胞的關(guān)鍵生物學(xué)特性，以確保適當(dāng)?shù)慕鈨龊蠊δ，包括?xì)胞完整性、代謝活性、增殖活性、分化潛力和治療功效的檢測(cè)[3, 69]。雖然使用膜完整性染料測(cè)量細(xì)胞的物理完整性是解凍后評(píng)估最廣泛的方法，但是用膜完整性作為衡量細(xì)胞存活率、功能的指標(biāo)并不可靠，還應(yīng)進(jìn)行其他關(guān)鍵生物學(xué)特性的表征，如代謝活性、增殖活性或反映細(xì)胞功能的指標(biāo)[70]。簡(jiǎn)而言之，活力和功能檢測(cè)是確定解凍后細(xì)胞質(zhì)量和提高當(dāng)前冷凍保存方法效率的重要判斷指標(biāo)。 
 
        細(xì)胞治療行業(yè)的規(guī)范化發(fā)展，涉及細(xì)胞運(yùn)輸、細(xì)胞儲(chǔ)存、細(xì)胞供應(yīng)的可用性以及質(zhì)量控制的時(shí)間，都需要考慮到冷凍保存方案/程序應(yīng)該在遵循GMP原則的同時(shí)提供大規(guī)模功能良好的細(xì)胞產(chǎn)品[65]。大容量程序化冷凍設(shè)備的發(fā)展和應(yīng)用，能解決細(xì)胞的大規(guī)模凍存的工業(yè)化問題，和促進(jìn)細(xì)胞治療行業(yè)的良好發(fā)展[71, 72]。

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